J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y H a e m o l y m p h c o m p o s i t i o n o f A n c y l o s t o m i a s t e r c o r e a Z e l l e r ( L e p i d o p t e r a : P y r a l i d a e ) l a r v a e w i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o p r o t e i n s a n d a m i n o a c i d s K e y w o r d s : A n c y l o s t o m i a s t e r c o r e a , h a e m o l y m p h , l a r v a e , C a j a n u s c a j a n . A B S T R A C T : H a e m o l y m p h o f 3 r d , 4 t h a n d 5 t h l a r v a l i n s t a r s o f A . s t e r c o r e a w a s e x t r a c t e d a n d u s e d i n t h e i d e n t i f i c a t i o n o f a m i n o a c i d s b y e l e c t r o p h o r e s i s , t o t a l p r o t e i n c o n t e n t b y L o w r y ’ s m e t h o d a n d p r o t e i n s b y S D S - P A G E . P o t a s s i u m , s o d i u m a n d g l u c o s e l e v e l s w e r e a l s o d e t e r m i n e d . S e v e n t e e n a m i n o a c i d s w e r e i d e n t i f i e d i n a l l t h r e e l a r v a l i n s t a r s . T h i r t e e n p r o t e i n b a n d s w e r e p r e s e n t i n t h e h a e m o l y m p h o f 4 t h a n d 5 t h l a r v a l i n s t a r s , f i v e o f w h i c h h a d m o l e c u l a r w e i g h t s o f > 4 5 . 4 k D a w h i l e t e n p r o t e i n b a n d s w e r e p r e s e n t i n t h e h a e m o l y m p h o f 3 r d l a r v a l i n s t a r . S o d i u m : P o t a s s i u m r a t i o s i n 3 r d , 4 t h a n d 5 t h l a r v a l i n s t a r s w e r e 0 . 0 5 , 0 . 1 4 a n d 0 . 1 3 r e s p e c t i v e l y . G l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s i n 3 r d , 4 t h a n d 5 t h l a r v a l i n s t a r s w e r e 0 . 1 6 , 0 . 3 3 a n d 0 . 5 7 m g / m l r e s p e c t i v e l y . T h e r e s u l t s p r o v i d e d c r i t i c a l i n f o r m a t i o n t h a t c a n b e u s e d t o c r e a t e a r t i f i c i a l d i e t s f o r i n - v i t r o r e a r i n g o f A . s t e r c o r e a p a r a s i t o i d s . 1 7 8 - 1 8 3 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 3 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : L a b b a n O , J u g m o h a n H , K h a n A , M a t t h e w J , W i s d o m S . I n s t i t u t i o n : D e p a r t m e n t o f L i f e S c i e n c e s U n i v e r s i t y o f t h e W e s t I n d i e s . S t . A u g u s t i n e T r i n i d a d . W e s t I n d i e s . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : K h a n A . E m a i l : a y u b . k h a n @ s t a . u w i . e d u . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 9 9 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 6 F e b 2 0 1 2 / A c c e p t e d : 2 5 F e b 2 0 1 2 / P u b l i s h e d : 1 3 M a r 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : L a b b a n O , J u g m o h a n H , K h a n A , M a t t h e w J , W i s d o m S . H a e m o l y m p h c o m p o s i t i o n o f a n c y l o s t o m i a s t e r c o r e a z e l l e r ( L e p i d o p t e r a P y r a l i d a e ) . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 7 8 - 1 8 3 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N P i g e o n p e a ( C a j a n u s c a j a n L . M i l l s p . ) i s a l e g u m i n o u s s h r u b t h a t o r i g i n a t e d i n I n d i a ( v a n d e r M a e s e n , 2 0 0 6 ) . I t w a s f o u n d i n W e s t A f r i c a a b o u t 2 0 0 0 B C a n d t h e s l a v e t r a d e r e d i s t r i b u t e d i t t o t h e W e s t I n d i e s , w h e r e i t ’ s u s e a s a b i r d f e e d l e d t o t h e n a m e “ p i g e o n p e a ” i n 1 6 9 2 . P i g e o n p e a f o r m s a n e s s e n t i a l p a r t o f t h e p r o t e i n d i e t f o u n d w i t h i n t h e C a r i b b e a n a n d c a n a l s o b e u s e d f o r a n u m b e r o f p u r p o s e s i n c l u d i n g a n i m a l f e e d a n d f i r e w o o d ( S h a n o w e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . F u r t h e r m o r e , p i g e o n p e a i m p r o v e s t h e s o i l t h r o u g h i t s e x t e n s i v e r o o t s y s t e m , n i t r o g e n f i x a t i o n a n d m u l c h p r o v i d e d b y t h e f a l l e n l e a v e s ( V a n d e r M a e s e n , 2 0 0 6 ) . T h e p l a n t i s p l a g u e d b y n u m e r o u s i n s e c t p e s t s t h r o u g h o u t t h e C a r i b b e a n a n d o t h e r a r e a s w h e r e i t i s g r o w n ( K h a n e t a l , 2 0 0 3 ) . T h e y a t t a c k a l l s t a g e s a n d p a r t s o f t h e p l a n t f r o m s e e d l i n g t o h a r v e s t a n d b e y o n d . H o w e v e r , d a m a g e c a u s e d b y l e p i d o p t e r o u s p o d b o r e r s i s v e r y s i g n i f i c a n t s i n c e t h e y a t t a c k t h e e d i b l e s e e d s r e n d e r i n g t h e m u n f i t f o r c o n s u m p t i o n . T h e m o s t i m p o r t a n t p o d b o r e r p e s t o f p i g e o n p e a i n t h e C a r i b b e a n a n d p a r t i c u l a r l y T r i n i d a d a n d T o b a g o i s A n c y l o s t o m i a s t e r c o r e a Z e l l e r ( L e p i d o p t e r a : P y r a l i d a e ) w h i c h c a u s e s s i g n i f i c a n t d a m a g e t o g r e e n s e e d s . B u c k m i r e ( 1 9 7 9 ) r e p o r t e d t h a t i n T r i n i d a d , o v e r 9 0 % o f t h e g r e e n p o d s c o u l d b e i n f e s t e d b y A . s t e r c o r e a . B e n n e t t ( 1 9 6 0 ) d e s c r i b e d t h e p e s t a s a m u l t i v o l t i n e s p e c i e s , d e p o s i t i n g i t s e g g s o n t h e y o u n g p o d s o f p i g e o n p e a ; t h e l a r v a e t h e n f e e d o n t h e d e v e l o p i n g s e e d s a n d l a t e r p u p a t e i n s o i l . T h e l i f e c y c l e i s c o m p l e t e d i n 2 6 - 3 2 d a y s . M a j o r c o n c e r n s r e g a r d i n g p e s t i c i d e o v e r u s e a n d i t s i m p a c t o n h u m a n h e a l t h a n d t h e e n v i r o n m e n t h a v e a r i s e n . A g r e a t d e a l o f e m p h a s i s h a s t h e r e f o r e b e e n p l a c e d o n f i n d i n g a l t e r n a t i v e s o l u t i o n s ( e . g . b i o l o g i c a l c o n t r o l ) t o l a r g e s c a l e u s e o f s y n t h e t i c i n s e c t i c i d e s . G u e r r a e t a l ( 1 9 9 3 ) n o t e s t h a t m a s s p r o d u c t i o n o f p a r a s i t o i d s f o r u s e i n b i o l o g i c a l p r o g r a m m e s r e q u i r e s v e r y c o s t l y i n v i v o t e c h n i q u e s w h i c h i n v o l v e m a s s p r o d u c t i o n o f h o s t i n s e c t s . R e s e a r c h e r s h a v e a t t e m p t e d t o d e v e l o p a r t i f i c i a l d i e t s c o n t a i n i n g i n s e c t h a e m o l y m p h o n w h i c h t o r e a r p a r a s i t o i d s , a n d s o s h o u l d b e a b l e t o c u t p r o d u c t i o n c o s t s d r a m a t i c a l l y . M a t t h e w s ( 1 9 7 4 ) c o n c u r r e d t h a t m o r e a t t e n t i o n s h o u l d b e p a i d t o t h e m a s s r e a r i n g e f f i c i e n c y o f p a r a s i t o i d s b y i n d u c i n g s p e c i e s t o o v i p o s i t d i r e c t l y a n d t o s u c c e s s f u l l y d e v e l o p u p o n a r t i f i c i a l n u t r i e n t m e d i a . H o w e v e r , t h e r e a r e s e v e r a l l i m i t i n g f a c t o r s h i n d e r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f t h e s e a r t i f i c i a l d i e t s , i n c l u d i n g t h e b i o c h e m i c a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e i n s e c t h o s t a n d p a r a s i t o i d a n d t h e l a c k o f u n d e r s t a n d i n g o f e n t o m o p h a g e p h y s i o l o g y a n d m e t a b o l i s m . T h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o d e t e r m i n e t h e h a e m o l y m p h c o m p o s i t i o n o f A . s t e r c o r e a w i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o p r o t e i n , a m i n o a c i d a n d i o n c o m p o s i t i o n a s a p r e - r e q u i s i t e s t e p i n a r t i f i c i a l r e a r i n g o f i t s m a j o r p a r a s i t o i d , B r a c o n t h u r b e r i p h a g a e M u e s b e c k ( H y m e n o p t e r a : B r a c o n i d a e ) . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S T h e e x p e r i m e n t w a s c a r r i e d o u t d u r i n g t h e m o n t h s o f M a r c h – M a y 2 0 1 0 . P i g e o n p e a p o d s f r o m f i e l d s w e r e c o l l e c t e d w i t h 3 r d , 4 t h a n d 5 t h l a r v a l s t a g e s o f A . s t e r c o r e a a n d k e p t i n c a g e s . H a e m o l y m p h f r o m 3 r d , 4 t h a n d 5 t h i n s t a r l a r v a e w a s e x t r a c t e d b y p i e r c i n g t h e c u t i c l e w i t h a t h i n , s h a r p i n s e c t m o u n t i n g p i n ( N o . 3 ) a n d s e p a r a t e l y c o l l e c t e d i n C o r n i n g P y r e x ® 5 µ l d i s p o s a b l e m i c r o p i p e t t e s ( C o r n i n g S c i e n c e P r o d u c t s , U S A ) . Z o n e e l e c t r o p h o r e s i s o f a m i n o a c i d s E l e c t r o p h o r e s i s o f a m i n o a c i d s i n t h e h a e m o l y m p h o f A . s t e r c o r e a l a r v a e w a s d o n e u s i n g a G e l m a n ® S e m i - m i c r o E l e c t r o p h o r e s i s c h a m b e r w i t h a 1 8 0 V D C s u p p l y . P h o s p h a t e b u f f e r ( 1 5 0 m l o f 0 . 1 M K H 2 P O 4 w a s a d d e d t o 9 0 m l o f 0 . 1 M N a O H a n d d i l u t e d t o 6 0 0 m l g i v i n g a p H o f 7 . 0 2 ) w a s p o u r e d i n t o t h e c h a m b e r t r a y u n t i l a l m o s t h a l f f i l l e d . T h e t r a y w a s g e n t l y t i l t e d t o e n s u r e t h a t t h e p h o s p h a t e b u f f e r w a s e q u a l i z e d i n a l l c o m p a r t m e n t s . S t r i p s ( 6 c m x 1 4 c m ) o f W h a t m a n ® N o . 1 f i l t e r p a p e r w e r e p l a c e d o n c l e a n p a p e r a n d a l i g h t p e n c i l l i n e w a s d r a w n a c r o s s t h e c e n t r e o f L a b b a n e t a l . , 2 0 1 2 1 7 9 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 7 8 - 1 8 3

e a c h s t r i p . O n e e n d w a s m a r k e d ( + ) t o b e i m m e r s e d i n t h e a n o d e a n d t h e o t h e r ( - ) t o b e i m m e r s e d i n t h e c a t h o d e . T h r e e e q u a l l y s p a c e d s m a l l d o t s w e r e m a r k e d o n t h e c e n t r e l i n e f o r a p p l i c a t i o n o f t w o s t a n d a r d a m i n o a c i d s a m p l e s ( 0 . 2 % ( w / v ) a m i n o a c i d s o l u t i o n s p r e s e r v e d w i t h a d r o p o f t o l u e n e ) a n d t h e o t h e r f o r t h e h a e m o l y m p h s a m p l e . 5 µ l o f e a c h s a m p l e w a s t r a n s f e r r e d t o i t s a p p r o p r i a t e s p o t a n d t h e s t r i p p l a c e d i n t h e c h a m b e r a n d r a n f o r 7 5 m i n u t e s a t t h e e n d o f w h i c h a g l a s s r o d w a s u s e d t o r e m o v e t h e p a p e r . T h e p a p e r w a s t h e n d r i e d w i t h a h a i r d r y e r f o r a b o u t 3 - 4 m i n u t e s a n d d i p p e d i n 0 . 3 % N i n h y d r i n s o l u t i o n ( 0 . 3 % ( w / v ) s o l u t i o n i n a c e t o n e + o n e d r o p o f p y r i d i n e a d d e d p e r 5 0 m L o f s o l u t i o n ) a n d d r i e d f o r a f u r t h e r 4 - 5 m i n u t e s . T h e a p p e a r a n c e o f c o l o u r e d s p o t s o n t h e p a p e r i n d i c a t e d t h e p o s i t i o n o f e a c h a m i n o a c i d . R e t e n t i o n f a c t o r ( R f ) v a l u e s w e r e t h e n c a l c u l a t e d f r o m t h e r e s u l t s c o l l e c t e d , u s i n g t h e f o l l o w i n g f o r m u l a : R f = D i s t a n c e m o v e d b y s p o t / D i s t a n c e m o v e d b y s o l v e n t f r o n t . T h e s e v a l u e s w e r e c o m p a r e d t o s t a n d a r d v a l u e s o f t h e a m i n o a c i d s u s e d a n d t h e a m i n o a c i d s p r e s e n t i n t h e h a e m o l y m p h s a m p l e s w e r e i d e n t i f i e d . P r o t e i n c o n t e n t a n d s e p a r a t i o n T o t a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e h a e m o l y m p h w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e L o w r y e t a l . ( 1 9 5 1 ) m e t h o d . B o v i n e S e r u m A l b u m i n ( 2 0 0 µ g / m L ) w a s u s e d a s t h e s t a n d a r d p r o t e i n . P r o t e i n s w e r e s e p a r a t e d u s i n g P A G E w i t h a r u n n i n g b u f f e r o f p H 8 . 3 ( 0 . 6 g T r i s , 2 . 8 8 g g l y c i n e i n 1 0 0 0 m l o f d e - i o n i z e d w a t e r ) a n d a p r o t e i n s t a i n o f 0 . 2 % C o o m a s s i e B l u e R - 2 5 0 i n 5 0 % m e t h a n o l : 1 0 % a c e t i c a c i d ( 0 . 2 g C o o m a s s i e B l u e R - 2 5 0 , 5 0 m l o f m e t h a n o l a n d 1 0 m l o f a c e t i c a c i d i n 1 0 0 m l o f w a t e r ) . G e l s w e r e d e - s t a i n e d u s i n g a s o l u t i o n o f 3 0 % m e t h a n o l : 1 0 % a c e t i c a c i d . A 7 . 5 % s e p a r a t i n g g e l ( 4 . 9 5 m l o f d e - i o n i z e d w a t e r , 2 . 5 0 m l o f 1 . 5 M T r i s - H C l ( p H 8 . 8 ) , 2 . 5 0 m l o f A c r y l a m i d e – B I S ( 3 0 % s t o c k ) , 5 0 μ l f r e s h l y p r e p a r e d 1 0 % A m m o n i u m P e r s u l p h a t e a n d 5 μ l T E M E D a n d a 4 % s t a c k i n g g e l ( 6 . 2 m l d e - i o n i z e d w a t e r , 2 . 5 m l 0 . 5 M T r i s - H C l ( p H 6 . 8 ) , 1 . 3 3 m l A c r y l a m i d e – B I S ( 3 0 % s t o c k ) , 5 0 μ l f r e s h l y p r e p a r e d 1 0 % A m m o n i u m P e r s u l p h a t e a n d 1 0 μ l o f T E M E D ) . T e n w e l l s e a c h w i t h 1 0 µ L / w e l l w a s u s e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n s p r e s e n t i n t h e h a e m o l y m p h o f 3 r d , 4 t h a n d 5 t h l a r v a l i n s t a r s w i t h e a c h s a m p l e c o m p r i s i n g : 3 µ L S a m p l e + 3 µ L S u c r o s e + 3 µ L B r o m o p h e n o l B l u e + 1 µ L R u n n i n g B u f f e r . α - L a c t a l b u m i n f r o m B o v i n e m i l k ( 1 4 . 2 k D a ) , C a r b o n i c A n h y d r a s e f r o m B o v i n e E r y t h r o c y t e s ( 2 9 k D a ) , A l b u m i n f r o m C h i c k e n e g g w h i t e ( 4 5 k D a ) , a n d U r e a s e f r o m J a c k B e a n ( 5 4 5 k D a ) w e r e u s e d a s m a r k e r s . S o d i u m , P o t a s s i u m a n d G l u c o s e d e t e r m i n a t i o n S o d i u m a n d p o t a s s i u m h a e m o l y m p h c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a S h e r w o o d F l a m e P h o t o m e t e r M o d e l 4 1 0 ( S h e r w o o d S c i e n t i f i c L t d , U K ) . T h e v a l u e s p r e s e n t e d r e p r e s e n t t h e m e a n s o f f i v e r e p l i c a t e s p e r i n s t a r . G l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s f o r e a c h i n s t a r w e r e d e t e r m i n e d u s i n g t h e m e t h o d o f F o l i n - W u ( 1 9 1 9 ) . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N A m i n o a c i d s F r e e a m i n o a c i d s , p r o t e i n s a n d o t h e r o r g a n i c i o n s a r e v e r y i m p o r t a n t c o m p o n e n t s o f p a r a s i t o i d d i e t s ( B a k e r a n d F a b r i c k , 2 0 0 0 ) . R e s e a r c h o n t h e n u t r i t i o n a l c o m p o n e n t s o f h o s t l a r v a e w h i c h c a n b e u t i l i z e d b y e c t o p a r a s i t o i d s t o s u p p o r t t h e i r l a r v a l g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t i s u s e f u l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f o p t i m a l a r t i f i c i a l d i e t s f o r t h e i n v i t r o r e a r i n g o f t h e s e e c t o p a r a s i t o i d s . T h e r e w e r e s e v e n t e e n a m i n o a c i d s i d e n t i f i e d i n a l l t h r e e l a r v a l i n s t a r s o f A . s t e r c o r e a ( T a b l e 1 ) . L e u c i n e w a s p r e s e n t i n 4 t h a n d 5 t h l a r v a l i n s t a r s b u t a b s e n t i n 3 r d l a r v a l i n s t a r . I s o l e u c i n e w a s p r e s e n t i n 3 r d a n d 5 t h l a r v a l i n s t a r s a n d a b s e n t i n 4 t h l a r v a l i n s t a r w h i l e t r y p t o p h a n w a s p r e s e n t i n 4 t h a n d 5 t h l a r v a l i n s t a r s b u t a b s e n t i n 3 r d l a r v a l i n s t a r ( T a b l e 1 ) . C h e n ( 1 9 6 2 ) n o t e d t h a t t e n a m i n o a c i d s ( a r g i n i n e , h i s t i d i n e , i s o l e u c i n e , l e u c i n e , l y s i n e , m e t h i o n i n e , p h e n y l a l a n i n e , t h r e o n i n e , t r y p t o p h a n , a n d v a l i n e ) h a v e b e e n p r o v e n t o b e e s s e n t i a l f o r i n s e c t g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t , a l l o f w h i c h w e r e p r e s e n t i n t h e i n s e c t l a r v a e i n v e s t i g a t e d . D u k e ( 1 9 8 3 ) L a b b a n e t a l . , 2 0 1 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 3 : 1 7 8 - 1 8 3 1 8 0