J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y S t u d i e s o n M e t h a n o t r o p h s f r o m L o n a r L a k e K e y w o r d s : L o n a r L a k e , m e t h a n o t r o p h s , A c i n e t o b a c t e r , P s e u d o m o n a s , A c h r o m o b a c t o r a n d O c h r o m o b a c t r u m . A B S T R A C T : M e t h a n o t r o p h i c b a c t e r i a w e r e i s o l a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d f r o m s e d i m e n t f r o m a l k a l i n e L o n a r L a k e . F o u r b a c t e r i a l s t r a i n s w e r e i s o l a t e d u s i n g m i n i m a l s a l t m e d i a t o s t u d y t h e m e t h a n o t r o p h s o f L o n a r L a k e a n d s e l e c t e d b a c t e r i a l s t r a i n s w e r e f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d , s c r e e n e d o n t h e b a s i s o f t h e t e m p e r a t u r e , a n d s a l t t o l e r a n c e . B a c t e r i a l i s o l a t e s w e r e s u b j e c t e d t o m o r p h o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d 1 6 S r R N A s e q u e n c i n g . I s o l a t e s w e r e r e l a t e d t o t h e p h y l u m p r o t e o b a c t e r i a c o n t a i n s d i f f e r e n t g e n e r a s u c h a s A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i , P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a , A c h r o m o b a c t o r x y l o s o x i d a n s a n d O c h r o m o b a c t r u m t r i t i c i . T h e s e r e s u l t s c l e a r l y s h o w e d t h a t t h e L o n a r l a k e e c o s y s t e m h a r b o r s u n e x p l o r e d m e t h a n o t r o p h s w h i c h c a n b e u s e d t o c o n t r o l g l o b a l w a r m i n g a s w e l l m e t h a n o l r e m e d i a t i o n . 2 3 0 - 2 3 6 | J R B | 2 0 1 1 | V o l 1 | N o 3 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : T a m b e k a r D H , P a t i l R V a n d P a w a r A L . I n s t i t u t i o n : P o s t G r a d u a t e D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , S . G . B . A m r a v a t i U n i v e r s i t y , A m r a v a t i 4 4 4 6 0 2 ( I n d i a ) . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : T a m b e k a r D H E m a i l : d i l i p t a m b e k a r @ r e d i f f m a i l . c o m W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 0 6 4 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 1 9 J u l 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 2 5 J u l 2 0 1 1 / P u b l i s h e d : 2 9 J u l 2 0 1 1 A r t i c l e C i t a t i o n : T a m b e k a r D H , P a t i l R V a n d P a w a r A L . S t u d i e s O n M e t h a n o t r o p h s f r o m L o n a r L a k e J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 2 3 0 - 2 3 6 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h p a p e r

I N T R O D U C T I O N T h e a l k a l i n e L o n a r L a k e , i n C e n t r a l I n d i a , s i t u a t e d i n t h e v i l l a g e a t L o n a r , B u l d h a n a d i s t r i c t , M a h a r a s h t r a r a n k s t h i r d i n t h e w o r l d b a s e d o n d i a m e t e r a n d i t s h i g h ( p H 1 0 . 5 ) a l k a l i n i t y ( T a i w a d e , 1 9 9 5 ) . I t i s a c l o s e d s y s t e m w i t h o u t o u t l e t s a n d r e g u l a r i n f l u e n t s a r e r e s p o n s i b l e f o r i t s e x i s t e n c e . B a s e d o n t h e g e o l o g i c a l s t u d i e s , i t i s p o s t u l a t e d t h a t t h e L a k e o r i g i n a t e d a s a m e t e o r i t e i m p a c t c r a t e r a r o u n d 5 0 - 5 3 t h o u s a n d y e a r s a g o ( J h i n g r a n a n d R a o , 1 9 5 4 ; N a n d y a n d D e o , 1 9 6 1 ) . T h e d i a m e t e r a r o u n d t h e L a k e i s a b o u t 1 . 7 5 K m a n d w a t e r e n t e r s t h e L a k e t h r o u g h r a i n , g r o u n d w a t e r s e e p a g e a n d t h e s p r i n g s s i t u a t e d i n t h e c l i f f s a t t h e e d g e o f t h e L a k e . I t d o e s n o t r e c e i v e a n y i n d u s t r i a l d i s c h a r g e s . A l k a l i n i t y o f t h e L a k e i s a t t r i b u t e d t o t h e h i g h c o n t e n t o f s o d i u m c a r b o n a t e a n d h e n c e w a s u s e d p r e v i o u s l y a s a s o u r c e o f w a s h i n g s o d a ( T h a k k e r a n d R a n a d e , 2 0 0 2 , ) . T h e w a t e r i n t h e c r a t e r i s v e r y s a l t y . I t i s 1 0 t i m e s s a l t i e r t h a n d r i n k i n g w a t e r . S a l t s a n d M i n e r a l s l i k e s o d i u m , c h l o r i d e , c a r b o n a t e s , f l u o r i d e s a n d b i c a r b o n a t e s ( T D S a r o u n d a r e f o u n d a n d a s t h i s w a t e r d o n o t d r a i n a w a y t h e s e s u b s t a n c e s g e t c o l l e c t e d b e n e a t h t h e s u r f a c e ( N a t h a n i , 2 0 1 0 , S h o e m a k e r , 1 9 6 3 ; B h a n d a r i , 1 9 8 4 ) . I n s u c h c o n d i t i o n s o n e c a n n o t t h i n k o f a n y l i v i n g o r g a n i s m s , b u t m i c r o o r g a n i s m s l i k e A r t h r o s p o r a , p r o t e o b a c t e r i a a n d a l g a e a r e f o u n d a b u n d a n t ( M a l u e t a l , 2 0 0 2 ) . I t r e v e a l e d t h a t L a k e w a t e r i s a l k a l i n e ( p H 1 0 . 3 ) a n d c h a r a c t e r i z e d b y h i g h c o n c e n t r a t i o n o f s a l t s ( 9 0 6 0 m g / l ) , c h l o r i d e ( 3 4 9 2 m g / l ) , s a l i n i t y ( 6 3 9 1 m g / l ) , a l k a l i n i t y ( 3 7 5 1 m g / l ) , t o t a l h a r d n e s s ( 4 8 0 m g / l ) , c a l c i u m h a r d n e s s ( 1 1 8 m g / l ) , m a g n e s i u m h a r d n e s s ( 3 6 1 m g / l ) , s u l p h a t e ( 2 1 m g / l ) , p h o s p h a t e ( 0 . 4 4 m g / l ) , n i t r a t e ( 3 . 7 m g / l ) a n d d i s s o l v e d o x y g e n ( 0 . 0 0 3 4 m g / l ) . T h e L o n a r L a k e i s u n i q u e i n t h e w o r l d f o r i t s a l k a l i n i t y a n d s a l i n i t y o f t h e w a t e r b u t i t w a s s e e n t h a t c h l o r i d e s a n d s a l i n i t y o f t h e L a k e w a t e r i s d e c r e a s i n g d a y b y d a y ( T a m b e k a r e t a l , 2 0 1 0 ) . M e t h a n o t r o p h i c b a c t e r i a a r e a g r o u p o f o r g a n i s m s w i t h t h e a b i l i t y t o u s e c o m p o u n d s w i t h n o c a r b o n - c a r b o n b o n d s ( C 1 c o m p o u n d s ) a s s i n g l e s o u r c e s o f c a r b o n a n d e n e r g y , t h u s p l a y i n g a r o l e i n g l o b a l c a r b o n c y c l i n g . A w i d e r a n g e o f C 1 c o m p o u n d s a r e c o n s u m e d b y m e t h a n o t r o p h s i n t h e e n v i r o n m e n t , i n c l u d i n g m e t h a n e , m e t h a n o l , m e t h y l a t e d a m i n e s , m e t h y l a t e d g l y c i n e s , h a l o m e t h a n e s , a n d m e t h y l a t e d s u l f u r s p e c i e s . M e t h a n o t r o p h s a r e a u n i q u e g r o u p o f M e t h y l o t r o p h i c b a c t e r i a , w h i c h u t i l i z e m e t h a n e a s s o l e c a r b o n a n d e n e r g y s o u r c e ( O l i v i e r e t a l , 2 0 0 5 ) . O x i d a t i o n o f m e t h a n e t o m e t h a n o l b y m e t h a n o t r o p h i c b a c t e r i a i s m e d i a t e d b y t h e p a r t i c u l a t e m e m b r a n e b o u n d f o r m ( p M M O ) o r t h e s o l u b l e c y t o p l a s m i c f o r m ( s M M O ) o f m e t h a n e m o n o o x y g e n a s e . T h e c o n v e r s i o n o f m e t h a n o l t o f o r m a l d e h y d e i s c a t a l y z e d i n e x t a n t m e t h a n o t r o p h s / m e t h y l o t r o p h s b y t h e m e t h a n o l d e h y d r o g e n a s e ( M D H ) e n z y m e . M e t h a n o l p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n g l o b a l w a r m i n g , a n d i t s a t m o s p h e r i c c o n c e n t r a t i o n h a s b e e n i n c r e a s i n g o v e r m a n y d e c a d e s a n d v e r y m u c h d i f f i c u l t t o d e g r a d e ( W h i t t e n b u r y e t a l , 1 9 7 0 ) . T h e p r e s e n t s t u d y p l a n n e d t o i s o l a t e m e t h a n o t r o p h i c b a c t e r i a p r e s e n t i n L o n a r l a k e s w h i c h c a n d e g r a d e t h e i n d u s t r i a l p o l l u t a n t m e t h a n o l a n d u t i l i z e m e t h a n e b y w h i c h t h e g l o b a l w a r m i n g c a n b e r e d u c e d . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S : F o u r s e d i m e n t s s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m s e l e c t e d s i t e s o f L o n a r L a k e w i t h t h e h e l p o f s c o o p e r i n s t e r i l e p o l y t h e n e b a g . T h e y w e r e l a b e l e d a n d t r a n s p o r t e d t o t h e l a b o r a t o r y a n d s t o r e d a t 4 0 C u n t i l f u r t h e r a n a l y s i s . M e d i u m c o m p o s i t i o n : T h e o n e l i t e r o f m e d i u m c o n t a i n i n g N a N O 3 2 . 5 g , K C L 0 . 1 g , K H 2 P O 4 3 g , K 2 H P O 4 0 . 0 1 g , M g S O 4 0 . 5 g , F e S O 4 0 . 1 1 6 g , H 3 B O 3 0 . 2 3 2 g , C u S O 4 0 . 4 1 g , M n S O 4 0 . 0 0 8 g , ( N H 4 ) 6 M o 7 O 2 4 , 0 . 0 0 8 g , a n d Z n S O 4 0 . 1 7 4 g , 2 0 m l m e t h a n o l a n d p H 1 0 w a s p r e p a r e d f o r i s o l a t i o n o f m e t h a n o t r o p h s ( H a d d a d e t a l , 2 0 0 9 ) . I s o l a t i o n o f b a c t e r i a l s t r a i n s : S e d i m e n t s a m p l e s w e r e i n o c u l a t e d i n m i n i m a l s a l t m e d i a c o n t a i n i n g 2 % m e t h a n o l a s c a r b o n s o u r c e . A l l f l a s k s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 0 C i n R o t a r y s h a k e r ( 1 0 0 r p m ) f o r 3 d a y s a n d r e p e a t e d s u b c u l t u r i n g w a s m a d e i n t h e s a m e m e d i u m . A f t e r r e p e a t e d s u b c u l t u r i n g , t h e b a c t e r i a l g r o w t h w a s s u b c u l t u r e d o n s a m e s o l i d m i n i m a l s a l t m e d i u m f o r i s o l a t i o n o f m e t h a n o t r o p h s . W e l l i s o l a t e d a n d d i f f e r e n t i a t e d c o l o n i e s f r o m t h e s e m i n i m a l m e d i a w e r e t r a n s f e r r e d o n N u t r i e n t a g a r s l a n t a n d m a i n t a i n e d f o r f u r t h e r s t u d y . M o r p h o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f i s o l a t e s : B a c t e r i a l s t r a i n s w e r e e x a m i n e d f o r c o l o n y a n d c e l l m o r p h o l o g y , m o t i l i t y , G r a m s t a i n i n g a n d s t a n d a r d b i o c h e m i c a l t e s t ( c a t a l a s e , o x i d a s e , I M V i C a n d f e r m e n t a t i o n o f s u g a r s u c h a s l a c t o s e , d e x t r o s e , m a n n i t o l , x y l o s e a n d a r a b i n o s e , n i t r a t e r e d u c t i o n , u r e a s e a c t i v i t y , m e t h y l , h y d r o l y s i s o f s t a r c h e t c ) . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s : 1 6 S r R N A s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d a t N C C S , P u n e . N e a r l y - f u l l - l e n g t h 1 6 S r R N A g e n e s e q u e n c e s w e r e s u b m i t t e d t o C H E C K - C H I M E R A , a v a i l a b l e o n t h e R i b o s o m a l D a t a b a s e 2 3 1 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 2 3 0 - 2 3 6 T a m b e k a r e t a l . , 2 0 1 1

P r o j e c t r e l e a s e 1 0 . 2 6 , i n o r d e r t o i d e n t i f y c h i m e r a s . P h y l o g e n e t i c a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e A R B s o f t w a r e p a c k a g e . T h e 1 6 S r R N A g e n e p h y l o g e n e t i c a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d b y t h e m a x i m u m - l i k e l i h o o d m e t h o d , u s i n g 1 , 2 8 5 t o 1 , 3 9 2 n u c l e o t i d e p o s i t i o n s . T h e f u n c t i o n a l g e n e s w e r e t r a n s l a t e d i n t o a m i n o a c i d s e q u e n c e s , a n d t h e s e w e r e i n c l u d e d i n p h y l o g e n e t i c a n a l y s e s u s i n g t h e n e i g h b o r - j o i n i n g m e t h o d ( D a y h o f f P A M m o d e l ) . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N : M e t h a n o t r o p h i c b a c t e r i a a r e a g r o u p o f o r g a n i s m s w i t h t h e a b i l i t y t o u s e c o m p o u n d s w i t h n o c a r b o n - c a r b o n b o n d s ( C 1 c o m p o u n d s ) a s s i n g l e s o u r c e s o f c a r b o n a n d e n e r g y , t h u s p l a y i n g a r o l e i n g l o b a l c a r b o n c y c l i n g . T r a d i t i o n a l m i c r o b i a l t e c h n i q u e s s u c h a s e n r i c h m e n t a n d i s o l a t i o n o n d e f i n e d c u l t u r e m e d i a h a v e r e v e a l e d t h a t m e t h a n o t r o p h i c b a c t e r i a o c c u r i n a v a r i e t y o f e n v i r o n m e n t s , s u c h a s f r e s h w a t e r , m a r i n e , a n d t e r r e s t r i a l h a b i t a t s , i n c l u d i n g h a b i t a t s c h a r a c t e r i z e d b y e x t r e m e c o n d i t i o n s o f t e m p e r a t u r e , s a l i n i t y , o r p H . A c t i v e m e m b e r s o f t h e b a c t e r i a l c o m m u n i t y i n t h e s e d i m e n t o f L o n a r L a k e w i t h s p e c i a l e m p h a s i s o n C 1 u t i l i z e r s ( M e t h a n o t r o p h s ) w e r e i d e n t i f i e d b y e m p l o y i n g t w o c o m p l e m e n t a r y c u l t u r e - d e p e n d e n t a n d i n d e p e n d e n t a p p r o a c h e s : m o r p h o l o g i c a l a n d s t a n d a r d b i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n a n d 1 6 S r R N A a n a l y s i s p r o b i n g C 1 s u b s t r a t e s m e t h a n o l . T h e o b j e c t i v e s o f t h i s s t u d y w e r e t o i s o l a t e , i d e n t i f y m e t h a n o l u t i l i z i n g b a c t e r i a l f r o m L o n a r L a k e a n d s t u d y f u r t h e r t o e v a l u a t e t h e i r p o t e n t i a l a s m e t h a n o t r o p h s . A p r e l i m i n a r y s t u d y w a s c a r r i e d o u t t o i s o l a t e t h e b a c t e r i a l s t r a i n s f r o m s e d i m e n t u s i n g M i n i m a l s a l t b r o t h . D a t a o f f o u r s e d i m e n t s a m p l e a s p e r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n a r e c o n f o r m e d u p t o g e n e r i c t h e l e v e l . F o u r d i f f e r e n t i s o l a t e d s t r a i n s w e r e i d e n t i f i e d b y u s i n g s t a n d a r d p r o c e d u r e s . T h e e x p e r i m e n t a l o u t c o m e o f m o r p h o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n p r o v e d t h a t a l l f o u r s t a i n s a r e G r a m n e g a t i v e a n d i d e n t i f i e d a s A c i n e t o b a c t e r , P s e u d o m o n a s , A c h r o m o b a c t o r , O c h r o m o b a c t r u m w h i c h p r o v e t o s u r v i v e i n e x t r e m o p h i l i c c o n d i t i o n o f h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n a n d h i g h p H ( 1 0 . 5 ) . P r e s e n t s t u d y r e p o r t e d t h a t 4 m e t h a n o t r o p h i c g r a m n e g a t i v e , b a c t e r i a l i s o l a t e s f r o m t h e s e d i m e n t s o f t h e L o n a r L a k e . A m o n g f o u r i s o l a t e s A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i w a s o x i d a s e n e g a t i v e a n d o t h e r t h r e e P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a , A c h r o m o b a c t e r x y l o s o x i d a n s a n d O c h r o m o b a c t r u m t r i t i c i w e r e p o s i t i v e . C a t a l a s e , i n d o l , m e t h y l r e d , v o g e s - p r o s k a u e r w e r e n e g a t i v e a n d c i t r a t e u t i l i z a t i o n w a s p o s i t i v e i n a l l i s o l a t e s . O n t h e b a s i s o f s u g a r f e r m e n t a t i o n , A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i f e r m e n t e d d e x t r o s e t h e o t h e r i s o l a t e s c a n n o t f e r m e n t t h e s u g a r s ; n i t r a t e r e d u c t a s e t e s t w a s p o s i t i v e f o r A c h r o m o b a c t e r x y l o s o x i d a n s a n d n e g a t i v e f o r a l l o t h e r . U r e a s e p r o d u c t i o n w a s a b s e n t f o r a l l i s o l a t e s . A m o n g f o u r b a c t e r i a l s t r a i n s A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i s h o w e d c l e a r z o n e o f s t a r c h h y d r o l y s i s i n d i c a t e a m y l a s e p r o d u c t i o n . T h e p r e s e n t s t u d i e s o n o p t i m i z a t i o n o f v a r i o u s g r o w t h p a r a m e t e r s s u c h a s t e m p e r a t u r e , s a l t c o n c e n t r a t i o n J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 1 ) 3 : 2 3 0 - 2 3 6 2 3 2 T a m b e k a r e t a l . , 2 0 1 1 T a b l e 1 : M o r p h o l o g i c a l , c u l t u r a l , b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d 1 6 S r R N A i d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a i s o l a t e d f r o m s e d i m e n t s o f L o n a r L a k e