J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y P r o d u c t i o n o f p r o t e a s e b y P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s i s o l a t e d f r o m a b a t t o i r e n v i r o n m e n t A B S T R A C T : T h e s t u d y i n v e s t i g a t e d t h e o p t i m u m c o n d i t i o n s o f t e m p e r a t u r e , p H , i n o c u l u m s i z e a n d t i m e o f i n c u b a t i o n o n b a c t e r i a l p r o t e a s e p r o d u c t i o n . P r o t e a s e p r o d u c i n g b a c t e r i a l s p e c i e s w e r e i s o l a t e d f r o m a b a t t o i r s o i l a n d i d e n t i f i e d a s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . T h e o p t i m u m c o n d i t i o n s o b s e r v e d f o r p r o t e a s e p r o d u c t i o n w a s 3 7 o C a t p H 9 , w i t h 2 % i n o c u l u m i n t h e m e d i u m f o r 2 4 h o f i n c u b a t i o n . P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a h a d h i g h e r p r o t e a s e a c t i v i t i e s a t o p t i m u m t e m p e r a t u r e a n d p H t h a n S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s w h i l e S . a u r e u s h a d h i g h e r p r o t e a s e a c t i v i t i e s a t o p t i m u m i n c u b a t i o n t i m e o f 2 4 h a n d i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n o f 2 % . T h e s t u d y g a v e e v i d e n c e t h a t t h e s e b a c t e r i a l i s o l a t e s c o u l d b e p o t e n t i a l l y a p p l i e d i n b i o t e c h n o l o g i c a l p r o c e s s e s . 0 7 7 - 0 8 2 | J R B | 2 0 1 2 | V o l 2 | N o 2 © F i c u s P u b l i s h e r s . T h i s O p e n A c c e s s a r t i c l e i s g o v e r n e d b y t h e C r e a t i v e C o m m o n s A t t r i b u t i o n L i c e n s e ( h t t p : / / c r e a t i v e c o m m o n s . o r g / l i c e n s e s / b y / 2 . 0 ) , w h i c h g i v e s p e r m i s s i o n f o r u n r e s t r i c t e d u s e , n o n - c o m m e r c i a l , d i s t r i b u t i o n , a n d r e p r o d u c t i o n i n a l l m e d i u m , p r o v i d e d t h e o r i g i n a l w o r k i s p r o p e r l y c i t e d . S u b m i t Y o u r M a n u s c r i p t w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m J o u r n a l o f R e s e a r c h i n b i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O p e n A c c e s s O n l i n e R e s e a r c h J o u r n a l A u t h o r s : A k u j o b i C O 1 , O d u N N 2 , O k o r o n d u S I 1 a n d I k e G N 1 . I n s t i t u t i o n : 1 . M i c r o b i o l o g y D e p a r t m e n t , F e d e r a l U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y , P M B 1 5 2 6 , O w e r r i , I m o S t a t e , N i g e r i a . 2 . M i c r o b i o l o g y D e p a r t m e n t , U n i v e r s i t y o f P o r t H a r c o u r t , C h o b a , P o r t H a r c o u r t , R i v e r s S t a t e , N i g e r i a . C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : A k u j o b i C O . E m a i l : c a m p b e l l 2 0 5 @ y a h o o . c o m . W e b A d d r e s s : h t t p : / / j r e s e a r c h b i o l o g y . c o m / D o c u m e n t s / R A 0 1 7 3 . p d f . D a t e s : R e c e i v e d : 3 1 D e c 2 0 1 1 / A c c e p t e d : 1 5 J a n 2 0 1 2 / P u b l i s h e d : 0 7 F e b 2 0 1 2 A r t i c l e C i t a t i o n : A k u j o b i C O , O d u N N , O k o r o n d u S I a n d I k e G N . P r o d u c t i o n o f p r o t e a s e b y P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s i s o l a t e d f r o m a b a t t o i r e n v i r o n m e n t . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 7 7 - 0 8 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y A n I n t e r n a t i o n a l O n l i n e O p e n A c c e s s P u b l i c a t i o n g r o u p O r i g i n a l R e s e a r c h

I N T R O D U C T I O N P r o t e a s e s a r e t h e m o s t i m p o r t a n t i n d u s t r i a l e n z y m e s t h a t e x e c u t e a w i d e v a r i e t y o f f u n c t i o n s a n d h a v e v a r i o u s i m p o r t a n t b i o t e c h n o l o g i c a l a p p l i c a t i o n s ( M o h e n a n d D i l e e , 2 0 0 5 ) . T h e y c o n s t i t u t e t w o t h i r d s o f t h e t o t a l e n z y m e s u s e d i n v a r i o u s i n d u s t r i e s a n d a c c o u n t f o r a t l e a s t a q u a r t e r o f t h e t o t a l g l o b a l e n z y m e s p r o d u c t i o n , w h i c h r e p r e s e n t a b o u t 6 0 % o f a l l t h e i n d u s t r i a l e n z y m e s s a l e s i n t h e w o r l d , d u e t o t h e i r a p p l i c a t i o n s i n s e v e r a l i n d u s t r i a l s e c t o r s ( K u m a r e t a l . , 2 0 0 2 ; G u p t a e t a l . , 2 0 0 2 ) . P r o p e r t i e s o f t h i s p r o t e a s e s u c h a s a l k a l i n e p H , t h e r m o s t a b i l i t y i n s o l v e n t s a n d d e t e r g e n t r e s i s t a n c e m a k e t h e e n z y m e u s e f u l f o r d i f f e r e n t a p p l i c a t i o n s . P r o t e o l y t i c e n z y m e p r o d u c e r s a r e a l s o h e l p f u l f o r t h e h e a l t h o f t h e e c o s y s t e m s o f t h i s e a r t h a s t h e s e m i c r o b e s d e c o m p o s e t h e d e a d a n d d e c a y i n g a n i m a l o r p l a n t t i s s u e s i n w a t e r o r l a n d . T h e y c a n c r e a t e p o l l u t i o n f r e e e n v i r o n m e n t a n d t h e y a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e r e c y c l i n g o f n u t r i e n t s ( G u p t a e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e i n d u c t i o n o f p r o t e a s e r e q u i r e s a s u b s t r a t e h a v i n g p e p t i d e b o n d s i n c l u d i n g s u b s t r a t e s l i k e p e p t o n e , c a s e i n a n d o t h e r p r o t e i n s . T h e a m m o n i a , a s f i n a l p r o d u c t o f e n z y m a t i c r e a c t i o n o f s u b s t r a t e h y d r o l y s i s , r e p r e s s e s e n z y m e s y n t h e s i s b y a w e l l - k n o w n m e c h a n i s m o f c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n . T h i s e x t r a c e l l u l a r p r o t e a s e h a s a l s o b e e n c o m m e r c i a l l y e x p l o i t e d t o a s s i s t p r o t e i n d e g r a d a t i o n i n v a r i o u s i n d u s t r i a l p r o c e s s e s ( S r i n u b a b u e t a l . 2 0 0 7 ) . T h e g r e a t a d v a n t a g e s o f f e r e d b y m i c r o b i a l e n z y m e s a r e l o w m a t e r i a l c o s t s c o u p l e d w i t h h i g h a n d f a s t e r p r o d u c t i v i t y a n d t h e e a s e w i t h w h i c h t h e e n z y m e s c a n b e m o d i f i e d ( S h a r m a e t a l . 2 0 0 7 ) . A t p r e s e n t , d u e t o h i g h c o s t o f s u b s t r a t e s a n d m e d i u m s u s e d , t h e o v e r a l l c o s t o f e n z y m e p r o d u c t i o n i s v e r y h i g h a n d t h e r e f o r e , d e v e l o p m e n t o f n o v e l p r o c e s s e s t o i n c r e a s e t h e y i e l d o f p r o t e a s e s w i t h r e s p e c t t o t h e i r i n d u s t r i a l r e q u i r e m e n t s c o u p l e d w i t h l o w e r i n g d o w n t h e p r o d u c t i o n c o s t i s h i g h l y a p p r e c i a b l e f r o m t h e c o m m e r c i a l p o i n t o f v i e w ( K a m m o u n e t a l . 2 0 0 8 ) . P r o t e a s e s s h o w v a r i e t y o f c h a r a c t e r i s t i c s u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s . M i c r o o r g a n i s m s , w h i c h p r o d u c e d e x t r a c e l l u l a r a c i d p r o t e a s e s , o f t e n a c i d i f y t h e m e d i u m i n w h i c h t h e y g r o w ( S h u m i , e t a l . , 2 0 0 4 ) , a n d t h e a b i l i t y t o p r o d u c e a l k a l i n e p r o t e i n a s e s h a s b e e n c o r r e l a t e d w i t h g r o w t h o f o r g a n i s m s a t n e u t r a l t o a l k a l i n e p H ( S h u m i , e t a l . , 2 0 0 4 ) . F o r m a t i o n o f p r o t e i n a s e s v a r i e s i n t h e p r e s e n c e o f d i f f e r e n t c a r b o n a n d n i t r o g e n s o u r c e s ( S h u m i e t a l . , 2 0 0 4 ) , m e d i u m p H ( H o s s a i n e t a l , 1 9 9 9 . ) , a n d a l s o t h e i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e a n d t i m e ( M a r z a n e t a l . , 2 0 0 4 ; S h u m i e t a l . , 2 0 0 4 ) . H e a t s t a b l e a l k a l i n e p r o t e a s e s , r e p o r t e d b y m a n y w o r k e r s ( T h a n g a m a n d R a j k u m a r , 2 0 0 2 ) , h a v e p o t e n t i a l f o r i n d u s t r i a l u s e . P r o t e a s e s a r e c o m p l e x m u l t i - e n z y m e s y s t e m w h i c h c a t a l y z e s t h e h y d r o l y s i s o f a m i d e b o n d i n a p r o t e i n m o l e c u l a r h e n c e i t h a s b e e n u s e d i n t h e f i e l d o f t e x t i l e p r o c e s s i n g f o r d e g u m m i n g o f s i l k a n d p r o c e s s i n g o f w o o l ( R a v e l a n d B a n e r j e e , 2 0 0 3 ; A d i n a r a y a n a e t a l . , 2 0 0 5 ) . W i t h t h e a d v e n t o f n e w f r o n t i e r s i n b i o t e c h n o l o g y , t h e s p e c t r u m o f p r o t e a s e a p p l i c a t i o n h a s e x p a n d e d i n t o m a n y n e w f i e l d s , s u c h a s c l i n i c a l , m e d i c i n a l a n d a n a l y t i c a l c h e m i s t r y . T o m e e t t h e c u r r e n t l a r g e l y i n c r e a s e d d e m a n d , s t u d i e s o n t h e c o s t - e f f e c t i v e p r o d u c t i o n o f i n d u s t r i a l l y i m p o r t a n t e n z y m e s h a v e b e c o m e t h e n e e d o f t h i s d a y . M i c r o o r g a n i s m s a r e t h e m o s t i m p o r t a n t s o u r c e s f o r e n z y m e p r o d u c t i o n . S e l e c t i o n o f t h e r i g h t o r g a n i s m p l a y s a k e y r o l e i n h i g h y i e l d o f d e s i r a b l e e n z y m e s . F o r p r o d u c t i o n o f e n z y m e s f o r i n d u s t r i a l u s e , i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f n e w p r o m i s i n g s t r a i n s u s i n g c h e a p c a r b o n a n d n i t r o g e n s o u r c e i s a c o n t i n u o u s p r o c e s s . H a b i t a t s t h a t c o n t a i n p r o t e i n a r e t h e b e s t s o u r c e s t o i s o l a t e p r o t e o l y t i c m i c r o o r g a n i s m s . W a s t e p r o d u c t s o f m e a t , p o u l t r y a n d f i s h p r o c e s s i n g i n d u s t r i e s c a n s u p p l y a l a r g e a m o u n t o f p r o t e i n r i c h m a t e r i a l s f o r b i o c o n v e r s i o n t o r e c o v e r a b l e p r o d u c t s ( D a l e v , 1 9 9 4 ) . T h e p r e s e n t s t u d y i s a i m e d a t t h e i s o l a t i o n o f p r o t e a s e p r o d u c i n g b a c t e r i a l s p e c i e s f r o m a b a t t o i r e n v i r o n m e n t a n d p o s s i b l y d e t e r m i n e s t h e o p t i m u m c o n d i t i o n s f o r p r o t e a s e a c t i v i t y . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S a m p l e C o l l e c t i o n a n d I s o l a t i o n o f P r o t e o l y t i c B a c t e r i a T h e s o i l s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m a n a b a t t o i r e n v i r o n m e n t i n O w e r r i , I m o S t a t e , N i g e r i a . T h e y w e r e s t o r e d i n i c e a n d a n a l y z e d w i t h i n o n e h o u r o f c o l l e c t i o n . O n e g r a m o f s o i l s a m p l e i n a 2 5 0 m l f l a s k w a s h o m o g e n i z e d w i t h 1 0 m l o f s t e r i l e w a t e r ; i t w a s l a t e r m a d e u p t o 1 0 0 m l w i t h s t e r i l e w a t e r , m i x e d a n d s h a k e n o n a m e c h a n i c a l s h a k e r f o r 4 5 m i n u t e s . A n a l i q u o t o f t h e h o m o g e n i z e d s a m p l e ( 0 . 2 m l ) w a s s p r e a d o n c a s e i n a g a r p l a t e s ( n u t r i e n t a g a r s u p p l e m e n t e d w i t h 3 6 % c a s e i n ) a n d i n c u b a t e d f o r 4 8 h o u r s a t 3 7 0 C . T h e i s o l a t e s w e r e i d e n t i f i e d b a s e d o n t h e i r m o r p h o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ( H o l t e t a l . 1 9 9 4 ) . S c r e e n i n g o f P r o t e o l y t i c B a c t e r i a I s o l a t e s w e r e p l a t e d o v e r n u t r i e n t a g a r m e d i u m t h a t c o n t a i n s 0 . 4 % g e l a t i n a n d i n c u b a t e d 0 7 8 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 7 7 - 0 8 2 A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2

a t 3 7 0 C f o r 2 4 h r s . P l a t e s w e r e f l o o d e d w i t h 1 % t a n n i c a c i d . I s o l a t e s h a v i n g a h i g h e r z o n e o f c l e a r i n g w e r e g r o w n i n l i q u i d b r o t h a n d s t o r e d f o r s u b s e q u e n t u s e . P r o t e a s e A c t i v i t y A s s a y T h e p r o t e a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f A n s o n ( 1 9 3 8 ) w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s . T h e i s o l a t e s w e r e g r o w n i n a m e d i u m c o n t a i n i n g 1 0 g o f g l u c o s e , 5 g o f c a s e i n , 5 g o f y e a s t e x t r a c t , 2 g o f K H 2 P O 4 a n d 1 0 g o f N a 2 C O 3 i n 1 0 0 m l o f s t e r i l e w a t e r . A f t e r s t e r i l i z a t i o n , t h e m e d i u m w a s i n o c u l a t e d a n d i n c u b a t e d a t 3 7 0 C f o r 4 8 h . A f t e r i n c u b a t i o n t h e c u l t u r e f i l t r a t e s w e r e c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 0 0 x g f o r 1 2 m i n u t e s a t 4 0 C . T h e s u p e r n a t a n t w a s u s e d a s c r u d e e n z y m e . A n a l i q u o t ( 0 . 5 m l ) o f t h e c r u d e e x t r a c t w a s m i x e d w i t h 5 . 0 m l o f T r i s - H c l b u f f e r e d c a s e i n a n d i n c u b a t e d a t 3 7 0 C f o r 3 0 m i n u t e s . A f t e r i n c u b a t i o n , 5 m l o f 1 1 0 m M T r i c h l o r o a c e t i c A c i d ( T C A ) w a s a d d e d t o s t o p t h e r e a c t i o n . T h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 r p m f o r f i v e m i n u t e s a n d t h e r e l e a s e d a m i n o a c i d s w e r e m e a s u r e d a s t y r o s i n e u s i n g t h e m e t h o d o f F o l i n a n d C i o c a l t e u , ( 1 9 2 9 ) b y c a l c u l a t i n g t h e a m o u n t o f t y r o s i n e i n t h e e x t r a c t u s i n g a t y r o s i n e s t a n d a r d c u r v e . T h e e n z y m e a c t i v i t y w a s e x p r e s s e d i n u n i t s ( U ) . O n e u n i t o f e n z y m e w a s d e f i n e d a s t h e a m o u n t o f e n z y m e t h a t r e l e a s e s 1 μ m o l o f t y r o s i n e p e r m l o f c r u d e e x t r a c t p e r m i n u t e . E f f e c t o f T e m p e r a t u r e o n P r o t e a s e P r o d u c t i o n T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n p r o t e a s e p r o d u c t i o n w a s s t u d i e d b y i n c u b a t i n g t h e c u l t u r e m e d i a a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 2 7 0 C - 7 7 0 C f o r 2 4 h r s . P r o t e a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d a f t e r 2 4 h r s o f i n c u b a t i o n . E f f e c t o f p H o n P r o t e a s e P r o d u c t i o n T h e e f f e c t o f p H o n p r o t e a s e p r o d u c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y c u l t u r i n g t h e b a c t e r i u m i n t h e p r o t e a s e p r o d u c t i o n m e d i a w i t h d i f f e r e n t p H r a n g e s ( p H 5 t o 1 1 ) . T h e e n z y m e a s s a y w a s c a r r i e d o u t a f t e r 2 4 h r s o f i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C . E f f e c t o f I n o c u l u m C o n c e n t r a t i o n o n P r o t e a s e P r o d u c t i o n E f f e c t o f I n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n o n p r o t e a s e p r o d u c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y i n o c u l a t i n g t h e p r o d u c t i o n m e d i u m w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 2 - 7 % ) o f o v e r n i g h t g r o w n b a c t e r i a l c u l t u r e . T h e i n o c u l a t e d m e d i u m w a s i n c u b a t e d a t 3 7 0 C f o r 2 4 h r s a f t e r w h i c h t h e c u l t u r e m e d i u m w a s c e n t r i f u g e d a t 5 0 0 0 r p m a t 4 0 C f o r 1 5 m i n s . T h e p r o t e a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d a s s t a t e d a b o v e . E f f e c t o f I n c u b a t i o n T i m e o n P r o t e a s e P r o d u c t i o n T h e e f f e c t o f i n c u b a t i o n t i m e o n p r o t e a s e p r o d u c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g t h e c u l t u r e m e d i u m a t 3 7 o C a n d a t d i f f e r e n t t i m e i n t e r v a l s ( 2 4 - 1 6 8 h r s ) w i t h s a m p l e s t a k e n f o r a n a l y s i s a t i n t e r v a l o f 2 4 h r s . P r o t e a s e a c t i v i t y w a s a l s o d e t e r m i n e d a s s t a t e d . S t a t i s t i c a l A n a l y s e s D a t a o b t a i n e d f r o m t h i s s t u d y w e r e a n a l y z e d u s i n g a o n e - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) a n d v a l u e s f o r P 0 . 0 5 w e r e c o n s i d e r e d s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . R E S U L T A N D D I S C U S S I O N T h e s t u d y i n v e s t i g a t e d t h e o p t i m u m c o n d i t i o n s f o r p r o t e a s e p r o d u c t i o n i n P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . T h e p a r a m e t e r s i n v e s t i g a t e d i n c l u d e d t h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e , p H , i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n a n d t i m e o f i n c u b a t i o n o n t h e p r o d u c t i o n o f p r o t e a s e . I t w a s d i s c o v e r e d t h a t t h e p a r a m e t e r s i n v e s t i g a t e d h a d v a r y i n g e f f e c t s o n t h e p r o t e a s e a c t i v i t i e s o f t h e i s o l a t e s . T e m p e r a t u r e h a d e f f e c t o n t h e p r o d u c t i o n o f p r o t e a s e i n b o t h o r g a n i s m s . I n P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a , t h e r e w a s a n i n c r e a s e i n p r o t e a s e p r o d u c t i o n w i t h i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e u p t o t h e t e m p e r a t u r e o f 3 7 o C . A f t e r t h i s t e m p e r a t u r e , t h e p r o t e a s e p r o d u c t i o n r e d u c e d a l i t t l e w i t h e q u a l p r o t e a s e a c t i v i t y a t 4 7 o C a n d 5 7 o C , r e d u c e d a l i t t l e m o r e a t t h e t e m p e r a t u r e o f 6 7 o C a n d r e d u c e d d r a s t i c a l l y a t 7 7 o C . T h e h i g h e s t p r o t e a s e p r o d u c t i o n w a s o b s e r v e d a t 3 7 o C , ( F i g . 1 ) . I n S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s , t h e r e w a s a n i n c r e a s e i n p r o t e a s e p r o d u c t i o n w i t h a n i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e u p t o t h e m a x i m u m a t 3 7 o C . A f t e r t h i s t e m p e r a t u r e , t h e p r o t e a s e p r o d u c t i o n d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e . G e n e r a l l y , t e m p e r a t u r e h a d s i g n i f i c a n t l y m o r e e f f e c t o n S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s t h a n P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a t P 0 . 0 5 . I t w a s d i s c o v e r e d t h a t t h e r e w a s a n i n c r e a s e i n p r o t e a s e p r o d u c t i o n w i t h i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e u p t o t h e m a x i m u m p r o t e a s e a c t i v i t i e s a t t h e t e m p e r a t u r e o f 3 7 o C i n b o t h o r g a n i s m s . K a l a i a r a s i a n d S u n i t h a ( 2 0 0 9 ) a l s o r e p o r t e d a s i m i l a r t r e n d i n P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s w h e r e t h e y o b s e r v e d t h a t t h e o r g a n i s m c o u l d p r o d u c e p r o t e a s e i n t h e r a n g e o f 2 7 - 5 7 o C w i t h p r o d u c t i o n m a x i m u m a t 3 7 o C . H o w e v e r , i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e b e y o n d 3 7 o C l e d t o t h e d e c l i n a t i o n o f p r o t e a s e p r o d u c t i o n p r o v i n g t h a t t e m p e r a t u r e p l a y s a m a j o r r o l e i n e n z y m e p r o d u c t i o n . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 7 7 - 0 8 2 0 7 9 A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2

0 8 0 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 7 7 - 0 8 2 T h e r e s u l t s h o w e d t h a t b o t h o r g a n i s m s w e r e a f f e c t e d b y a n i n c r e a s e i n p H . I n b o t h o r g a n i s m s , p r o t e a s e p r o d u c t i o n i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s e i n p H , ( F i g . 2 ) . T h e i r m a x i m u m p r o t e a s e p r o d u c t i o n s w e r e a t p H 9 . H o w e v e r , a t p H 9 , P . a e r u g i n o s a h a d s l i g h t l y m o r e p r o t e a s e a c t i v i t y ( 1 . 2 4 8 4 7 U / m l / m i n ) t h a n S . a u r e u s ( 1 . 2 3 5 8 7 U / m l / m i n ) . T h e l o w e s t p r o t e a s e a c t i v i t i e s i n b o t h o r g a n i s m s w e r e a t p H 1 1 . A t p H 6 a n d 7 , b o t h o r g a n i s m s h a d e q u a l p r o t e a s e a c t i v i t i e s ( 1 . 1 9 8 0 4 U / m l / m i n ) . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s s h o w e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e o n t h e e f f e c t o f p H o n t h e p r o t e a s e a c t i v i t i e s o f b o t h o r g a n i s m s , ( P 0 . 0 5 ) . T h e p H o f t h e c u l t u r e s t r o n g l y a f f e c t s m a n y e n z y m a t i c p r o c e s s e s a n d t r a n s p o r t o f c o m p o u n d s a c r o s s t h e c e l l m e m b r a n e . I n c r e a s e i n p H r e s u l t e d i n c o r r e s p o n d i n g i n c r e a s e i n p r o t e a s e p r o d u c t i o n u p t o t h e m a x i m u m p r o t e a s e p r o d u c t i o n a t p H 9 ( 1 . 2 4 8 4 7 U / m l / m i m a n d 1 . 2 3 5 8 7 U / m l / m i n , r e s p e c t i v e l y f o r P . a e r u g i n o s a a n d S . a u r e u s ) . T h e r e s u l t s h o w e d t h a t t h e r e w a s a s t i m u l a t i o n o f t h e e n z y m e p r o d u c t i o n a t a l k a l i n e p H . T h e r e s u l t o b t a i n e d i s i n c o n s o n a n c e w i t h t h e w o r k o f K u m a r e t a l . ( 2 0 0 2 ) w h o r e p o r t e d t h a t p r o t e a s e p r o d u c t i o n w a s a t m a x i m u m i n p H 7 a n d 9 f o r B a c i l l u s s p . a n d P s e u d o m o n a s s p . r e s p e c t i v e l y . T h i s s a m e r e s u l t w a s a l s o o b t a i n e d b y A m a r a e t a l . ( 2 0 0 9 ) a n d S a t h e e s K u m a r e t a l . ( 2 0 1 1 ) w h o o b s e r v e d a n o p t i m u m p r o t e a s e a c t i v i t y o f 3 4 U n i t / m l a n d 2 1 5 . 5 6 U / m l f o r G e o b a c i l l u s s p a n d P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a , r e s p e c t i v e l y a t p H 9 . T h i s w a s h o w e v e r a t v a r i a n c e w i t h t h e w o r k o f S a l l y , ( 2 0 0 0 ) w h o , u s i n g A z o c o l l a s a p r o t e a s e s u b s t r a t e , o b s e r v e d h i g h e s t s p e c i f i c p r o t e a s e a c t i v i t y o f B u r k h o l d e r i a s t r a i n 2 . 2 N a t p H 7 . 5 . I n c r e a s e i n i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d t h e p r o t e a s e a c t i v i t y i n b o t h o r g a n i s m s u p t o t h e m a x i m u m a t 2 % i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n . I n c r e a s i n g t h e i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n b e y o n d 2 % r e s u l t e d i n t h e d e c r e a s e o f p r o t e a s e a c t i v i t y o f b o t h o r g a n i s m s ( F i g . 3 ) . T h e r e w a s a v e r y h i g h s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e e f f e c t o f i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n o n p r o t e a s e a c t i v i t i e s o f b o t h o r g a n i s m s a t P 0 . 0 5 . S . a u r e u s h a d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r p r o t e a s e a c t i v i t i e s t h a n P . a e r u g i n o s a . I n i t i a l i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n i n f l u e n c e d t h e p r o d u c t i o n o f p r o t e a s e i n b o t h o r g a n i s m s . I t w a s o b s e r v e d t h a t i n c r e a s e i n i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d t h e p r o t e a s e a c t i v i t y i n b o t h o r g a n i s m s u p t o t h e m a x i m u m o f 1 . 1 0 4 9 6 U / m l / m i n a n d 1 . 1 9 8 0 4 U / m l / m i n , r e s p e c t i v e l y f o r P . a e r u g i n o s a a n d S . a u r e u s a t 2 % i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n . T h e s e r e s u l t s w e r e i n a c c o r d a n c e w i t h E l i b o l e t a l . ( 2 0 0 5 ) w h o r e p o r t e d t h a t 2 . 5 % i n o c u l u m l e v e l g i v e s h i g h e r p r o t e a s e p r o d u c t i o n . T h e r e s u l t o f t h e e f f e c t o f t i m e o f i n c u b a t i o n f o r p r o t e a s e p r o d u c t i o n s h o w e d t h a t t h e r e w a s a d r a s t i c d e c r e a s e i n p r o t e a s e p r o d u c t i o n w i t h i n c r e a s e i n t h e t i m e o f i n c u b a t i o n i n b o t h o r g a n i s m s ( F i g . 4 ) . T h e h i g h e s t p r o t e a s e a c t i v i t y o b s e r v e d i n b o t h o r g a n i s m s w a s a t 2 4 h o u r s o f i n c u b a t i o n . I n P . a e r u g i n o s a , t h e r e w a s n o f u r t h e r d e c r e a s e i n p r o t e a s e a c t i v i t y b e t w e e n 1 2 0 a n d 1 4 4 h o u r s o f i n c u b a t i o n . A f t e r 1 4 4 h o u r s o f i n c u b a t i o n , t h e r e w a s a v e r y s h a r p d e c r e a s e i n p r o t e a s e p r o d u c t i o n a t 1 6 8 h o u r s o f i n c u b a t i o n . I n S . a u r e u s , t h e r e w a s n o f u r t h e r d e c r e a s e i n p r o t e a s e p r o d u c t i o n f r o m 9 6 A k u j o b i a l . , 2 0 1 2 F i g . 1 . E f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n p r o t e a s e a c t i v i t i e s o f t h e i s o l a t e s P r o t e a s e A c t i v i t y ( U / m l / m i n 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 1 . 2 1 . 4 0 2 4 6 8 1 0 1 2 P r o t e a s e A c t i v i t y ( U / m l / m i n ) p H F i g . 2 . E f f e c t o f p H o n p r o t e a s e a c t i v i t i e s o f t h e i s o l a t e s P . a e r u g i n o s a S . a u r e u s F i g . 2 . E f f e c t o f p H o n p r o t e a s e a c t i v i t i e s o f t h e i s o l a t e s P r o t e a s e A c t i v i t y ( U / m l / m i n P r o t e a s e A c t i v i t y ( U / m l / m i n F i g . 3 . E f f e c t o f i n o c u l u m c o n c e n t r a t i o n o n p r o t e a s e a c t i v i t i e s o f t h e i s o l a t e s

h o u r s o f i n c u b a t i o n t i l l 1 6 8 h o u r s o f i n c u b a t i o n . B o t h o r g a n i s m s h a d e q u a l p r o t e a s e a c t i v i t i e s a t 1 2 0 a n d 1 4 4 h o u r s o f i n c u b a t i o n ( 1 . 1 3 4 9 9 U / m l / m i n ) . H o w e v e r , t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e o n t h e e f f e c t o f i n c u b a t i o n t i m e o n p r o t e a s e a c t i v i t i e s o f b o t h o r g a n i s m s , ( P 0 . 0 5 ) . T h e h i g h e s t p r o t e a s e a c t i v i t y o b s e r v e d i n b o t h o r g a n i s m s w a s a t 2 4 h o u r s o f i n c u b a t i o n . T h i s f i n d i n g i s i n p a r t i a l a g r e e m e n t w i t h t h e w o r k o f K u m a r e t a l . ( 2 0 0 2 ) w h o r e p o r t e d t h a t P s e u d o m o n a s s p . S 2 2 s h o w e d a p e a k f o r p r o t e a s e p r o d u c t i o n a t 2 4 h o f i n c u b a t i o n a n d a g a i n a t 1 0 8 h o f i n c u b a t i o n . H o w e v e r , t h e p r e s e n t r e s u l t i s i n t o t a l a g r e e m e n t w i t h t h e w o r k o f K a l a i a r a s i a n d S u n i t h a ( 2 0 0 9 ) w h o o b s e r v e d t h e s a m e p e a k p r o t e a s e p r o d u c t i o n a t 2 4 h o f i n c u b a t i o n . T h e d a t a g a t h e r e d i n t h i s s t u d y h a s p r o v i d e d e v i d e n c e f o r t h e p r o t e a s e p r o d u c i n g a b i l i t y o f a b a t t o i r - s o i l - i s o l a t e d P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . T h e i n f l u e n c e o f e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s o n t h e p r o t e a s e p r o d u c t i o n o f t h e i s o l a t e s w a s a l s o e v i d e n t i n t h i s s t u d y a s i s b e i n g c o r r o b o r a t e d b y s o m e o t h e r a u t h o r s ( T a m b e k a r a n d T a m b e k a r , 2 0 1 1 ) . T h i s s t u d y h a s g i v e n a h i n t t h a t t h e m i c r o b i a l w e a l t h o f p r o t e a s e p r o d u c i n g b a c t e r i a i s o l a t e d f r o m a b a t t o i r e n v i r o n m e n t c a n b e h a r n e s s e d f o r b i o t e c h n o l o g i c a l p r o c e s s e s . T h e a p p r e c i a b l e h i g h e n z y m e a c t i v i t y a t a l k a l i n e p H s u g g e s t e d t h a t P . a e r u g i n o s a a n d S . a u r e u s a r e p o t e n t i a l p r o d u c e r s o f a l k a l i n e p r o t e a s e s w h i c h c a n f i n d a p p l i c a t i o n i n d e t e r g e n t a n d t e x t i l e i n d u s t r i e s . R E F E R E N C E S A d i n a r a y a n a K , J y o t h i B a n d E l l a i a h P . 2 0 0 5 . P r o d u c t i o n o f A l k a l i n e P r o t e a s e w i t h I m m o b i l i z e d c e l l s o f B a c i l l u s s u b t i l i s P E - 1 1 i n V a r i o u s M a t r i c e s b y E n t r a p m e n t T e c h n i q u e s . A A p s . J . P h a r m . S c i . T e c h n o l . , 6 : 3 9 1 - 3 9 7 . A m a r a A A , S a l e m S R a n d S h a b e b M S A . 2 0 0 9 . T h e p o s s i b i l i t y t o u s e b a c t e r i a l p r o t e a s e a n d l i p a s e a s b i o d e t e r g e n t . G l o b a l J . B i o t e c h n o l . B i o c h e m . , 4 ( 2 ) : 1 0 4 - 1 1 4 . A n s o n M L . 1 9 3 8 . T h e E s t i m a t i o n o f P e p s i n , T r y p s i n , P a p a i n a n d C a t h e p s i n w i t h H e m o g l o b i n . J . G e n . P h y s i o l . , 2 2 : 7 9 - 8 9 . D a l e v P G . 1 9 9 4 . U t i l i z a t i o n o f W a s t e F e a t h e r s f r o m P o u l t r y S l a u g h t e r f o r P r o d u c t i o n o f a P r o t e i n C o n c e n t r a t e . J . B i o r e s . T e c h n o l . , 4 8 : 2 6 5 - 2 6 7 . E l i b o l M , A n t o u i o R a n d M o r e i r a S . 2 0 0 5 . O p t i m i z i n g s o m e f a c t o r s a f f e c t i n g a l k a l i n e p r o t e a s e p r o d u c t i o n i n a m a r i n e b a c t e r i u m T e r c l i n o b a c t e r t u r b i r a e u n d e r s o l i d s u b s t r a t e f e r m e n t a t i o n . P r o c e s s B i o c h e m . , 4 0 : 1 9 5 1 - 1 9 5 6 . F o l i n O a n d C i o c a l t e a u V J . 1 9 2 9 . O n T y r o s i n e a n d T r y p t o p h a n D e t e r m i n a t i o n s i n P r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . , 7 3 : 6 2 - 6 5 0 . G u p t a R , B e g Q K a n d L o r e n z P . 2 0 0 2 . B a c t e r i a l a l k a l i n e p r o t e a s e s : m o l e c u l a r a p p r o a c h e s a n d i n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n s . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 5 9 ( 1 ) : 1 5 - 3 2 . G u p t a A , J o s e p h B , M o n i A a n d T h o m a s G . 2 0 0 7 . B i o s y n t h e s i s a n d p r o p e r t i e s o f a n e x t r a c e l l u l a r t h e r m o s t a b l e s e r i n e a l k a l i n e p r o t e a s e f r o m V i r g i b a c i l l u s p a n t h e n t i c u s . J . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 3 6 : 4 1 7 - 4 2 6 . H o l t J G , K r i e g N R , S n e a t h P H A , S t a l e y J T , 1 9 9 4 . W i l l i a m s T . B e r g e y s M a n u a l o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y . 9 t h e d . W i l l i a m s a n d W i l k i n s , B a l t i m o r e , U S A . 1 - 5 0 . H o s s a i n M T , A k t e r S . R a h m a n M S . M a n c h u r M A a n d A n w a r M N . 1 9 9 9 . I s o l a t i o n o f p r o t e a s e p r o d u c i n g f u n g i a n d t h e i r p r o t e a s e a c t i v i t y . T h e C h i t t a g o n g U n i v . J . S c i . , 2 3 : 1 0 1 - 6 . K a l a i a r a s i K a n d S u n i t h a P U . 2 0 0 9 . O p t i m i z a t i o n o f a l k a l i n e p r o t e a s e p r o d u c t i o n f r o m P s u e d o m o n a s f l u o r e s c e n s i s o l a t e d f r o m m e a t w a s t e c o n t a m i n a t e d s o i l . A f r i . J . B i o t e c h n o l . , 8 ( 2 4 ) : 7 0 3 5 - 7 0 4 1 . J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 7 7 - 0 8 2 0 8 1 A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2 P r o t e a s e A c t i v i t y ( U / m l / m i n F i g . 4 . E f f e c t o f t i m e o f i n c u b a t i o n o n p r o t e a s e a c t i v i t i e s o f t h e i s o l a t e s T i m e o f I n c u b a t i o n ( h r s )

K a m m o u n R , N a i l i B a n d B e j a r S . 2 0 0 8 . A p p l i c a t i o n o f a s t a t i s t i c a l d e s i g n t o t h e o p t i m i z a t i o n o f p a r a m e t e r s a n d c u l t u r e m e d i u m f o r a - a m y l a s e p r o d u c t i o n b y A s p e r g i l l u s o r y z a e C B S 8 1 9 . 7 2 g r o w n o n g r u e l ( w h e a t g r i n d i n g b y - p r o d u c t ) . B i o r e s . T e c h n o l . , 9 9 : 5 6 0 2 - 5 6 0 9 . K u m a r A , S a c h d e v A , B a l a s u b r a m a n y a m S D a n d S a x e n a A K . 2 0 0 2 . O p t i m i z a t i o n o f C o n d i t i o n s f o r P r o d u c t i o n o f N e u t r a l a n d A l k a l i n e P r o t e a s e f r o m S p e c i e s o f B a c i l l u s a n d P s e u d o m o n a s . J . M i c r o b i o l . , 4 2 : 2 3 3 - 2 3 6 . M a r z a n L W , M a n c h u r M A , H o s s a i n M T a n d A n w a r M N . 2 0 0 4 . P r o t e a s e p r o d u c t i o n b y a s t r a i n A s p e r g i l l u s f u n i c u l o s u s . B a n g l a d e s h J . L i f e S c i . , 1 6 : 1 0 3 - 7 . M o h e n F N a n d D i l e e D . 2 0 0 5 . P o t e n t i a l A p p l i c a t i o n o f P r o t e a s e I s o l a t e d f r o m P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a P D 1 0 0 . J . B i o t e c h n o l . , 8 : 1 9 7 - 2 0 3 . R a v e l H a n d B a n e r j e e S E . 2 0 0 3 . E f f e c t o f E n z y m e a n d C h e m i c a l P r e t r e a t m e n t s o n t h e P r o p e r t i e s o f S i l k . J . T e x t . A s s o c . , 6 4 : 6 5 - 6 9 . S a l l y N J . 2 0 0 0 . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l p r o t e a s e f r o m B u r k h o l d e r i a s t r a i n 2 . 2 N . M . S c T h e s i s , M i c r o b i o l o g y D e p a r t m e n t , V i r g i n i a P o l y t e c h n i c I n s t i t u t e a n d S t a t e U n i v e r s i t y , U S A . 3 4 - 6 0 . S a t h e e s K u m a r R , P r o b h u D , S h a n k a r T , S a n k a r a l i n g a m S a n d A n a n d a p a n d i a n K T K . 2 0 1 1 . O p t i m i z a t i o n o f a l k a l o p h i l i c p r o t e a s e b y P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a i s o l a t e d f r o m t h e g u t o f P e n a u s m o n o d o n . W o r l d J . F i s h a n d M a r i n e S c i . , 3 ( 5 ) : 3 7 1 - 3 7 5 . S h a r m a P , G o e l R a n d C a p a l a s h N . 2 0 0 7 . B a c t e r i a l l a c c a s e s . W o r l d J . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . , 2 3 : 8 2 3 - 8 3 2 . S h u m i W , H o s s a i n M T a n d A n w a r M N . 2 0 0 4 . I s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f A s p e r g i l l u s f u n i c u l o s u s G . S m i t h a n d i t s e n z y m e p r o t e a s e . P a k i s t a n J . B i o l . S c i . , 7 : 3 1 2 - 7 . S r i n u b a b u G , L o k e s w a r i N a n d J a y a r a j u K . 2 0 0 7 . S c r e e n i n g o f n u t r i t i o n a l p a r a m e t e r s f o r t h e p r o d u c t i o n o f p r o t e a s e f r o m A s p e r g i l l u s o r y z a e . E - J o u r n a l o f c h e m . , 4 ( 2 ) : 2 0 8 - 2 1 5 . T h a n g a m B E a n d R a j k u m a r G S . 2 0 0 2 . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a l k a l i n e p r o t e a s e f r o m A l c a l i g e n e s f a e c a l i s . B i o t e c h n o l . A p p l . B i o c h e m . , 3 5 : 1 4 9 - 5 4 . T a m b e k a r D H a n d T a m b e k a r S D . 2 0 1 1 . P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d o p t i m i z a t i o n o f p r o t e a s e p r o d u c t i o n f r o m n e w l y i s o l a t e d C o h n e l l a t h e r m o t o l e r a n s f r o m L o n a r L a k e . J o u r n a l o f r e s e a r c h i n B i o l o g y 4 : 2 9 2 - 2 9 8 . 0 8 2 J o u r n a l o f R e s e a r c h i n B i o l o g y ( 2 0 1 2 ) 2 : 0 7 7 - 0 8 2 A k u j o b i e t a l . , 2 0 1 2 S u b m i t y o u r a r t i c l e s o n l i n e a t F i c u s p u b l i s h e r s . c o m A d v a n t a g e s E a s y o n l i n e s u b m i s s i o n C o m p l e t e P e e r r e v i e w A f f o r d a b l e C h a r g e s Q u i c k p r o c e s s i n g E x t e n s i v e i n d e x i n g O p e n A c c e s s a n d Q u i c k s p r e a d i n g Y o u r e t a i n s y o u r c o p y r i g h t s u b m i t @ f i c u s p u b l i s h e r s . c o m w w w . f i c u s p u b l i s h e r s . c o m / s u b m i t 1 . a s p x .